MEDIOS Y MÉTODOS MODERNOS PARA LA INDICACIÓN DE AGENTES BIOLÓGICOS EN EL MEDIO AMBIENTE.

HERRAMIENTAS Y MÉTODOS MODERNOS PARA LA INDICACIÓN DE AGENTES BIOLÓGICOS DEL MEDIO AMBIENTE.

MEDIOS Y MÉTODOS MODERNOS DE INDICACIÓN DE AGENTES BIOLÓGICOS EN EL MEDIO AMBIENTE

Evgeniy Nikolaevich KHRAMOV,
Doctor en Ciencias Técnicas, Profesor, Subdirector del Centro Científico Estatal «Instituto Estatal de Investigaciones en Instrumentación Biológica»

Conferencia pronunciada el 24 de marzo de 2005 en el Instituto de Física y Tecnología de Moscú
para estudiantes del curso No proliferación y reducción de armas de destrucción masiva y seguridad nacional (http://armscontrol.ru/course/)

El problema del biomonitoreo bajo amenaza de actos terroristas determina la necesidad de desarrollar métodos altamente sensibles y específicos (selectivos) para detectar patógenos y crear, basándose en estos métodos, medios técnicos avanzados adecuados para organizar las medidas de protección necesarias.

Se sabe que la confiabilidad de la protección de la población, en igualdad de condiciones, depende directamente de la efectividad de cada uno de los eslabones de la protección antibiológica (APP): control biológico, prevención de emergencia (o6shche y especial), restricción del aislamiento. y otras medidas para eliminar las consecuencias del uso de bioagentes, continuidad, coherencia de las acciones de las unidades de inteligencia NBQ y las unidades del Ministerio de Situaciones de Emergencia, el Ministerio del Interior, las tropas de protección NBQ, las unidades de servicios médicos de la Dirección Médica Militar Principal del Ministerio de Defensa de la Federación Rusa, el Ministerio de Salud y otros, brindando protección contra objetos biológicos.

Las principales tareas que enfrenta el control biológico son detectar el uso de un agente biológico, establecer el tipo de patógeno utilizado, los límites de la infección y el momento de aplicación y retirada del equipo de protección.

En el sistema de control biológico existente, actualmente, para solucionar el problema de detectar el hecho de uso, se realiza una detección expresa inespecífica de una serie de signos (niveles elevados de proteínas, presencia de actividad enzimática de la muestra analizada, etc.). En este caso, también se supone que se realizará un muestreo para realizar la siguiente tarea: establecer el tipo de patógeno utilizado, que se asigna a los métodos y medios de indicación específica.

En general, la protección antibiológica incluye:
    — control biológico y evaluación (previsión) de la situación biológica; uso de equipos de protección individual y colectiva;
    — tratamiento especial, incluido el tratamiento sanitario del personal, desinfección de objetos, terrenos, caminos, estructuras;
    — prevención de emergencia (general y especial) de lesiones y vacunación (revacunación);
    — medidas restrictivas de aislamiento y evacuación médica;
    — maniobrando reservas móviles.

De lo anterior, el control biológico tiene una importancia decisiva. Los datos obtenidos durante el seguimiento sirven como base para evaluar la situación biológica, elaborar propuestas de protección frente a agentes biológicos, indicando la naturaleza, volumen y momento de las medidas para eliminar las consecuencias de su uso en cada caso concreto.

La aplicación de equipos de protección individual y colectiva, desinfección, prevención general y especial, observación o cuarentena también se realiza según los datos de control biológico (indicación biológica no específica e indicación específica).

Al mismo tiempo, es evidente que cuanto antes se apliquen determinadas medidas, más aumentará su eficacia, incluida la económica.

Por otro lado, el uso operativo de los recursos individuales Los elementos de un conjunto de medidas de protección contra agentes biológicos deben llevarse a cabo sobre la base de información confiable y completa sobre la situación biológica.

Por lo tanto, una característica esencial del proceso de PBP es que todas las actividades posteriores se llevan a cabo con base en los resultados de un análisis de la situación biológica. Al mismo tiempo, el sistema de biocontrol, que incluye NBI y SI, es el factor principal que realiza las capacidades potenciales de los medios y métodos existentes de protección contra agentes biológicos.

Al resolver el problema de la seguridad alimentaria, hay que tener en cuenta que en la actualidad sigue existiendo un peligro potencial por el uso de agentes biológicos por parte de algunos estados, porque no existen mecanismos confiables para monitorear el cumplimiento de la Convención de 1972 y es difícil distinguir entre actividades de protección permitidas e investigaciones para mejorar objetos biológicos. Además, el problema del bioterrorismo ha adquirido recientemente especial relevancia. Un análisis de las consecuencias del uso de BD realizado por expertos estadounidenses muestra que para una ciudad con una población de 100 mil habitantes, los daños materiales pueden oscilar entre 470 millones y 22 mil millones de dólares, dependiendo del tipo de BD utilizado, el El número de afectados con desenlace fatal puede llegar a 35 mil personas. Cabe destacar especialmente que la detección eficaz de agentes biológicos y, en consecuencia, la organización de la protección, es posible si existe información sobre los posibles métodos y medios de uso de agentes biológicos, lo que en sí mismo es la tarea más difícil.

Se cree que la forma más probable de infectar objetos cuando se usa BD es la ruta de propagación de BA en aerosol (aerogénica).

Para garantizar las medidas NBI y SI , el sistema de biocontrol debe incluir los siguientes conjuntos de medios técnicos:
    — Dispositivos NBI de acción local y remota, diseñados para establecer el hecho del uso de armas biológicas;
    — kits (paquetes) para la detección no específica de sustancias biológicamente activas en muestras (este grupo de equipos técnicos también puede incluir instrumentos para equipar laboratorios);
    — medios de muestreo y entrega de muestras;
    — medios (automáticos, semiautomáticos y kits) para la determinación autónoma o de laboratorio de la especie o grupo de BS en muestras, incluidos aquellos que permitan el enriquecimiento biológico de la muestra con el fin de emitir una respuesta final que permita identificar el agente causal de la enfermedad.

Para coordinar las actividades de PBP, también deben existir canales de comunicación para la transmisión a sistemas de control automatizados, y los vehículos deben tener las interfaces necesarias para transmitir y recibir señales. Los vehículos deben estar ubicados en vehículos adecuados que proporcionen control biológico, entrega de muestras y análisis (vehículos de reconocimiento RCH, helicópteros, laboratorios médico y sanitario-epidemiológicos).

Actualmente, el estándar significa de protección de seguridad (alarma ASP y microscopio MLD), que son la base material del sistema de biocontrol existente, no pueden resolver suficientemente los problemas que enfrenta la PBP. En base a esto, la creación de medios técnicos nuevos y más modernos es una importante tarea actual.

Para resolver los problemas del biomonitoreo, es necesario desarrollar métodos altamente sensibles y específicos (selectivos) para indicar patógenos y ecopatógenos y crear medios técnicos modernos basados ​​en estos métodos.

Sin embargo, existen Actualmente no existen documentos reglamentarios y de normas técnicas (NTD) que regulen los requisitos para el sistema de monitoreo biológico y sus componentes.

Al mismo tiempo, a finales de los años 90, especialistas de los ministerios y departamentos interesados ​​del país, junto con el Instituto Estatal de Investigación de BP, desarrollaron proactivamente un borrador de documento científico y técnico “Sistema de Requisitos Técnicos Generales. Medios del sistema de vigilancia biológica y ecológica del medio ambiente.”

De acuerdo con este documento, dependiendo del propósito y principio de funcionamiento, los medios del sistema de vigilancia biológica y ecológica El monitoreo del medio ambiente debe incluir los siguientes grupos de clasificación:
    — alarmas automáticas de aerosoles biológicos;
    — analizadores automáticos de agentes biológicos;
    — dispositivos de muestreo de alto rendimiento para aerosoles biológicos;
    — dispositivos automáticos (semiautomáticos) para indicar objetos biológicos;
    — equipos, dispositivos, kits, kits y dispositivos para la detección e identificación de objetos biológicos;
    — equipos para controlar, recopilar y procesar datos.

En el sistema propuesto, las alarmas automáticas de aerosoles biológicos deben monitorear (monitorear) constantemente la contaminación de la capa de aire del suelo, asegurando la detección de un aerosol biológico en la nube a su paso por un punto controlado.

Los analizadores automáticos de agentes biológicos en funcionamiento periódico deben garantizar la diferenciación de los agentes biológicos en estado de aerosol en los siguientes grupos taxonómicos convencionales: virus, rickettsias, bacterias (por separado en forma vegetativa y esporada), toxinas bacterianas.

Los dispositivos de aerosol biológico de alto rendimiento están diseñados para recolectar muestras representativas de agentes biológicos del aire y almacenarlas en condiciones que garanticen la máxima preservación de la viabilidad.

Los dispositivos automáticos (semiautomáticos) para indicar agentes biológicos deben proporcionar información expresa — indicación (establecimiento de la presencia dentro de grupos taxonómicos convencionales) de agentes biológicos y productos de síntesis microbiológica en muestras nativas seleccionadas mediante dispositivos de muestreo de aerosoles biológicos de alto rendimiento.

Los equipos, instrumentos, kits, kits y dispositivos para la detección e identificación de agentes biológicos deben garantizar la identificación de especies (tipos) de patógenos de enfermedades infecciosas y toxinas bacterianas en muestras nativas y enriquecidas de aire, suelo, agua y otros objetos ambientales. .

La tarea principal del sistema propuesto y sus elementos es establecer el hecho de la contaminación biológica.

Para resolver este problema, en En la primera etapa se realiza la detección inespecífica, que también se encarga del muestreo para indicación específica. Posteriormente, en la segunda etapa, se realiza una indicación específica.

En nuestro país, por primera vez en el mundo, se desarrolló un medio técnico para detectar BS en estado de aerosol. La alarma ASP creada se basa en el método de análisis quimioluminiscente del luminol. La decisión sobre la presencia de bioaerosol en la capa superficial de la atmósfera durante la alarma ASP se toma comparando el umbral electrónico con la señal analítica registrada utilizando un tubo fotomultiplicador durante una reacción quimioluminiscente de luminol catalizada por partículas de aerosol con actividad peroxidasa. . El exceso de la amplitud de la señal analítica por encima del umbral electrónico sirve de hecho como base para notificar el uso de BA.

Al ser el dispositivo más utilizado para la indicación no específica de objetos biológicos, La alarma ASP tiene varias de las siguientes desventajas importantes que reducen su eficiencia de detección debido al uso de bioaerosol:
    — rango limitado de bioaerosoles detectables debido al bajo nivel de actividad peroxidasa o su ausencia en varios BA;
    — deterioro del umbral de sensibilidad al detectar bioaerosol BA en una atmósfera polvorienta.

También debe tenerse en cuenta que para el funcionamiento continuo de la alarma según lo previsto durante el día, se necesitan cuatro litros de reactivo indicador de Se requiere el kit de indicadores (CIS) incluido en el dispositivo.

Es aconsejable mejorar aún más estos dispositivos con el fin de reducir las características peso-dimensionales y el consumo de energía mediante el uso de las últimas tecnologías para detectar la luminiscencia y la dispersión de la luz de partículas y una base elemental moderna (dispositivo fotodetector, sistemas de detección óptica láser semiconductores compactos y tecnología de microprocesador).

Las alarmas están equipadas con dispositivos de muestreo diseñados para tomar una muestra de un aerosol de agentes biológicos para su posterior análisis utilizando métodos de indicación específicos y llevando a cabo medidas de protección biológica.

Para el ASP alarma, este dispositivo tiene la forma de un ciclón incorporado, al que se suministra aire después de la detección de BA. El flujo volumétrico de aire a través del ciclón es de 160-220 l/min. Las partículas seleccionadas tienen un diámetro medio de más de 2,5 micras.

Actualmente se está desarrollando un dispositivo de muestreo de alto rendimiento, cuyo diseño incluye, como elemento obligatorio, un concentrador de la fracción de aerosol respirable con una dispersión de 1 a 10 micras. En este caso, su productividad debe ser de al menos 1,5-2 m/min.

Las principales características técnicas de los dispositivos de muestreo existentes y desarrollados se dan en la tabla. 1.

MEDIOS DE MUESTREO PARA INDICACIONES ESPECÍFICAS

Junto con el desarrollo de alarmas automáticas en los años 80 y 90. GosNII BP desarrolló medios remotos para indicar aerosoles de BS biológico. Los complejos LIDAR terrestres se basaron en el método luminiscente de registro de aerosoles biológicos a una distancia de hasta varios kilómetros, que se utilizó con éxito para monitorear las emisiones de BVK de las plantas bioquímicas de Kirishi y Svetlogorsk.

Para la detección no específica de objetos biológicos en muestras, se utilizan kits de campo portátiles, diseñados para analizar muestras con el fin de clasificarlas inicialmente. La tarea principal al utilizar kits — obteniendo una respuesta preliminar rápida, en 10-15 minutos, sobre la presencia y afiliación grupal de materiales biológicos.

Para ello se utiliza un conjunto de reacciones colorimétricas, enzimáticas y pruebas bioquímicas características de Se utilizan varios grupos de objetos biológicos.

Utilizando las reacciones y pruebas indicadas del Instituto Estatal de Investigación de BP, se desarrollaron los conjuntos de herramientas de análisis de muestras KSP-11 y KSAP. Los kits están diseñados para la detección e indicación grupal de microorganismos que causan enfermedades infecciosas en condiciones de campo.

Los papeles indicadores, soluciones humectantes, reactivos, disolventes, instrumentos y materiales incluidos en los kits garantizan la selección, preparación y análisis de muestras y microorganismos desconocidos. La asignación del microorganismo que se está determinando a grupos taxonómicos se puede realizar de acuerdo con el conjunto correspondiente de reacciones positivas y negativas de los agentes indicadores incluidos en los kits.

El kit KSAP proporciona información parcial indicación grupal de microorganismos (con la asignación de microorganismos detectados a grupos vegetativos virales-rickettsiales y bacterianos) en objetos ambientales en el rango de temperatura de -20 a 30°C. El equipo es atendido por un operador.

Actualmente, el kit KSAP se está modernizando con el fin de ampliar su funcionalidad para clasificar los microorganismos que se están determinando además de los grupos taxonómicos de esporas virales y bacterianas.

Actualmente, se utilizan los siguientes métodos para resolver problemas de indicación específica: medios de análisis microbiológico exprés: método de anticuerpos fluorescentes (IFA), reacción de hemaglutinación indirecta (IRHA), método de inmunoabsorción ligada a enzimas (ELISA).

La sensibilidad de MPA y RNGA es de 105.. 106 mt/ml.

El esquema de indicación específica también implica el enriquecimiento biológico y el estudio de MPA y RNGA por métodos, también se utilizan animales de laboratorio. , los estudios tardan hasta 2-3 días. Si se recibe una respuesta negativa, se realiza un análisis microbiológico completo. Puede tardar hasta 36 días o más. Este momento de análisis ya no es aceptable en la actualidad.

La base de casi todos los métodos utilizados para indicaciones específicas son determinadas modificaciones de los métodos inmunológicos (inmunoquímicos). Fue la insuficiente eficacia del análisis biológico clásico lo que sirvió de fuerza impulsora para el desarrollo de métodos inmunoquímicos y de amplificación (hibridación) para la indicación y el diagnóstico específicos de patógenos de enfermedades infecciosas.

En particular, en el Instituto Estatal de Investigación de BP se han desarrollado más métodos para el análisis de inmunofluorescencia de biomateriales en el volumen de muestra. Uno de ellos es el método de concentración polifásica universal de complejos de bioagentes (virus, microorganismos, toxinas) con anticuerpos marcados con isotiocianato de fluoresceína (FITC). Las principales desventajas de este método son su baja resistencia a altas concentraciones de impurezas que interfieren y la fuerte influencia del grado de purificación de los anticuerpos en los resultados del análisis. Estas desventajas se superaron utilizando soluciones con diferentes densidades específicas como sistema de dos fases. En este caso, se observa un pico de luminiscencia en la zona de densidad de equilibrio, provocado por la formación de un complejo inmunológico del bioagente con inmunoglobulinas luminiscentes. Al mismo tiempo, altas concentraciones de impurezas se distribuyen en una de las fases de acuerdo con su densidad y no interfieren con la determinación.

La mejora de los métodos y medios técnicos expresa — La indicación basada en inmunoensayo luminiscente en fase sólida tiene como objetivo buscar nuevas etiquetas luminiscentes y métodos de detección que proporcionen un aumento significativo en la relación señal-fondo. Alto nivel de sensibilidad 10 …10″ M (en términos de concentración de etiqueta) se logró mediante el uso de etiquetas con una luminiscencia anormalmente duradera y un método especial para su aislamiento en un modo de resolución temporal con corte del componente de fondo de corta duración. Este enfoque se implementó en un ensayo de inmunofluorescencia de lantánidos, el llamado método ELISA o inmunoensayo de fluorescencia de lantánidos potenciado por disociación. Se utilizaron como marcadores quelatos de lantánidos (Eu, Tb, Dy, Sm) unidos covalentemente a anticuerpos. Este método ha demostrado su eficacia en el diagnóstico de infecciones virales. Sin embargo, el método ELISA resultó insuficientemente eficaz para el análisis multicomponente de agentes infecciosos de alta sensibilidad. Esto se debe a una disminución en la sensibilidad del método cuando se utilizan otras etiquetas de tierras raras con luminiscencia más débil en lugar de Eu.

El análisis genético molecular tiene la mayor sensibilidad de todos los métodos de indicación rápida conocidos. El uso de etiquetas fluorescentes tradicionales para la detección de bioagentes mediante ADN — Las sondas, por regla general, pueden detectar de cientos a miles de células en una muestra. La amplificación del material genético mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) del ácido nucleico reduce este umbral a células individuales. El desarrollo de la metodología PCR se considera actualmente como una de las direcciones más importantes para crear métodos sensibles y específicos para indicar e identificar patógenos que no tienen igual entre los métodos de diagnóstico de laboratorio en términos de sensibilidad y especificidad de análisis. Al mismo tiempo, como lo demuestra la experiencia en la aplicación práctica de la PCR en el kit KPBK-1U creado en 2001 para la indicación expresa de patógenos, las limitaciones importantes del método son su duración y la baja inmunidad al ruido de la contaminación por los productos de reacción. En este sentido, una de las direcciones para mejorar la metodología de la PCR para fines de indicación específicos es el desarrollo de técnicas metodológicas y la creación de sondas luminiscentes de nueva generación que pueden reducir significativamente el número de ciclos de amplificación al aumentar la sensibilidad de la detección del marcador. Como en el caso del inmunoensayo en fase sólida, lo más prometedor es el uso de marcadores luminiscentes largos a base de quelatos de lantánidos o metaloporfirinas. Los métodos de amplificación de ácidos nucleicos permiten aumentar la sensibilidad de los métodos inmunoquímicos para detectar toxinas y antígenos mediante la creación de moléculas de anticuerpos híbridas marcadas con oligonucleótidos. El análisis en fase sólida pasa por dos etapas. En la primera etapa, el complejo del analito deseado y las moléculas híbridas de anticuerpo asociadas se adsorbe en la fase sólida; en la segunda etapa, el ácido nucleico se amplifica y se detecta utilizando diversas sondas de ADN, incluidas las luminiscentes.

Actualmente, las técnicas tradicionales de ensayo de inmunofluorescencia con marcado de anticuerpos FITC todavía dominan el trabajo práctico. Al mismo tiempo, la base moderna de la microscopía luminiscente permite el uso de varios fluorocromos que difieren en características espectrales y luminiscentes, lo que puede proporcionar una identificación mucho más confiable de patógenos. La funcionalidad de los métodos de microscopía de inmunoluminiscencia se amplía mediante el uso de etiquetas luminiscentes de larga duración y el registro de la señal de luminiscencia en modo fosforimetría o excitación de dos fotones con corte del fondo de luminiscencia.

Al parecer, la combinación de tecnologías modernas de ultramicroanálisis utilizadas en microscopía de luminiscencia, como la excitación láser de la luminiscencia de sondas de ADN con registro en modo fosforescente o excitación de dos fotones, con el reconocimiento de patrones por ordenador permitirá eliminar los pasos de amplificación y controlar la presencia. de bioagentes en la muestra directamente por el nivel de señal de luminiscencia. Sin embargo, la complejidad y el elevado coste del equipamiento necesario para realizar este tipo de análisis hacen que sólo sea posible implementarlo en grandes centros de diagnóstico.

Una de las direcciones en el desarrollo de medios para la indicación rápida de patógenos es la creación de inmunosensores luminiscentes. En esta área predominan los enfoques metodológicos que utilizan etiquetas luminiscentes de larga duración con registro en modo de resolución temporal. Al mismo tiempo, un análisis de los datos de la literatura científica y técnica muestra que, a diferencia de los inmunosensores electroquímicos semiconductores, la creación de sensores inmunoluminiscentes capilares y de fibra óptica no ha abandonado actualmente la etapa de desarrollo científico, metodológico y tecnológico.

Los resultados presentados indican la posibilidad de mejorar los indicadores express basándose en una combinación de métodos modernos de análisis genético inmunoquímico y molecular con los últimos avances en el campo de la creación de etiquetas luminiscentes, técnicas para registrar flujos de luz ultradébiles en modo de conteo de fotones y espectroscopia láser. métodos. Los problemas de la indicación rápida de agentes biológicos, ni en la actualidad ni en el futuro próximo, aparentemente, pueden resolverse utilizando cualquier método universal.

Para estudios relacionados con la necesidad de una detección rápida de patógenos y toxinas, las tecnologías de inmunosensores y las tecnologías que implementan los principios del inmunoensayo homogéneo son óptimas.

Para los laboratorios estacionarios, las características de los métodos como la sensibilidad, la especificidad y la productividad son de primordial importancia, mientras que el factor tiempo de análisis es menos importante. En esta situación, aparentemente dominarán sobre los demás los métodos de hibridación molecular y el inmunoensayo multicomponente en fase sólida con registro de productos de unión bioespecíficos en el modo de luminiscencia resuelta en el tiempo, que se complementan mutuamente.

Como medio sencillo y prometedor para indicar la EA en el medio ambiente, sin duda debe reconocerse el método de análisis en tiras reactivas inmunocromatográficas que utilizan oro coloidal o grafito como etiquetas. En este sentido, el instituto está realizando una intensa investigación, especialmente desde que se creó la base tecnológica y de producción de la química «seca» para resolver el problema de los medios de diagnóstico para los pacientes con diabetes.

En conclusión, cabe señalar que la complejidad de las tareas y un enfoque integrado de los problemas de la bioindicación requiere una mejora constante de la estructura organizativa, que a su vez puede reformarse sobre la base de éxitos reales en el desarrollo de métodos y medios técnicos de indicación. . Teniendo en cuenta la estructura organizativa existente y las tareas específicas de los distintos departamentos, se pueden identificar una serie de áreas clave en el desarrollo de herramientas de indicación:
    — biosensores e inmunosensores personales;
    — pilas de campo y kits de procesamiento de muestras;
    — medios para equipar laboratorios de automóviles, incl. dispositivos para la selección y análisis totalmente automatizados de muestras biológicas;
    — medios para el monitoreo automático continuo y periódico del agua y del aire;
    — instrumentos y conjuntos de herramientas de diagnóstico para laboratorios estacionarios.

Siempre debe recordarse que a pesar de la necesidad de desarrollar métodos para diagnosticar enfermedades infecciosas, donde una persona actúa como detector, se puede lograr una reducción significativa en las consecuencias del posible uso de BA, incl. en caso de bioterrorismo, sólo es posible detectar estos materiales biológicos de manera oportuna, lo que se logra mediante el uso generalizado de medios técnicos de indicación.