Что такое ВЭЖХ?

Что такое ВЭЖХ?

ВЭЖХ (высокоэффективная жидкостная хроматография) — это метод разделения и обнаружения отдельных соединений в образце посредством взаимодействия между колонкой и образцом. Он очень эффективен для измерения и обнаружения следовых количеств компонентов и широко используется в таких отраслях, как фармацевтика, биохимия, пищевая промышленность и экологические исследования.

Поскольку площадь пика ВЭЖХ пропорциональна концентрации образца, можно количественно определить концентрацию компонентов в образце. Поведение разделения образцов в ВЭЖХ варьируется в зависимости от колонки и подвижной фазы, что требует разработки соответствующих условий анализа.

Как использовать ВЭЖХ и их применение

Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) — это аналитический метод, который использует взаимодействие между колонкой и образцом для разделения каждого компонента в образце. Метод прост: анализ можно выполнить путем прямого введения раствора образца или путем помещения раствора образца в автосэмплер для пакетной обработки.

ВЭЖХ используется в различных отраслях промышленности. В фармацевтической области они используются для анализа следовых примесей и активных ингредиентов. В пищевой, безалкогольной и экологической отраслях они анализируют пищевые ингредиенты, функциональные компоненты, добавки и остатки пестицидов. В биохимии ВЭЖХ используется для анализа белков и веществ, связанных с нуклеиновыми кислотами.

Принципы ВЭЖХ и используемые колонки

ВЭЖХ и газовая хроматография (ГХ) являются типами хроматографии. Этот метод разделяет соединения, содержащиеся в аналите, пропуская их через колонку, что позволяет адсорбироваться на колонке или другой среде. Среда, через которую протекают компоненты образца, например, растворитель в ВЭЖХ или газ в ГХ, называется «подвижной фазой», тогда как среда, в которой образец адсорбируется, например, колонка, является «неподвижной фазой».

Тип и сила взаимодействия между компонентами образца и колонкой различаются в зависимости от типа колонки. Например, в колонке ODS алкильная цепь (октадецильная группа) связана с колонкой, что позволяет образцу адсорбироваться посредством гидрофобного взаимодействия. Силикагелевые колонки имеют силанольные группы на поверхности, которые адсорбируют полярные соединения. Другие типы колонок включают модифицированные фенильными группами, цианогруппами и аминогруппами.

Расчет концентрации с использованием площади пика ВЭЖХ

Площадь пика ВЭЖХ пропорциональна концентрации образца. Однако при использовании УФ-детектора площадь пика меняется в зависимости от коэффициента поглощения (легкости поглощения света), даже если концентрация образца одинакова. Поэтому при анализе концентраций с помощью ВЭЖХ необходимо подготовить стандартные образцы для сравнения площадей.

Одним из методов анализа концентрации является «метод внешнего стандарта». Он включает подготовку нескольких стандартных образцов с известными концентрациями для анализа ВЭЖХ и определение площадей пиков. Поскольку концентрация каждого образца известна, уравнение для определения концентрации из значения площади можно получить, построив график значения площади против концентрации.

Второй метод — «метод внутреннего стандарта». Здесь другое соединение, химически и физически стабильное, добавляется в качестве внутреннего стандарта к стандартному образцу с известной концентрацией. После добавления выполняется анализ ВЭЖХ для определения отношения площади пика стандартного образца к площади пика внутреннего стандарта. Калибровочную кривую можно получить, используя отношение количества добавленного внутреннего стандарта в качестве абсциссы и отношение площади пика в качестве ординаты.

Детекторы ВЭЖХ и пределы обнаружения

В качестве детекторов ВЭЖХ служат различные приборы, включая детекторы ультрафиолетового и видимого диапазонов (УФ-Вид), флуоресцентные детекторы и дифференциальные рефрактометрические детекторы (РИД). Пределы обнаружения этих детекторов сильно различаются в зависимости от образца. Например, детектор UV-Vis имеет предел обнаружения около 10 пикограмм (пг), а детектор флуоресценции — 0,1 пг.

Наиболее чувствительным является масс-спектрометр (МС), который, по оценкам, имеет чувствительность обнаружения 0,01 пг. Однако предел обнаружения зависит от типа и концентрации соединений в образце, степени разделения и иногда дериватизации. Оптимизация анализа ВЭЖХ, включая предварительную обработку образца, необходима для высокочувствительного обнаружения.